Synthèse et structure − Relations d’activité des inhibiteurs de benzothiénothiazépinone de la protéine kinase D


Le diacylglycérol (DAG) est un messager secondaire des lipides clé qui cible principalement protéine kinase C (PKC) dans les cellules.En plus de la PKC, un nombre croissant de récepteurs DAG ont été découverts: la protéine kinase D (PKD), les protéines activatrices de la chimaérine Rac GTPase, les protéines RAS de Ras guanyl (RasGRPs), les Munc13 et les DAG kinases (DGKs). ) .2 On pense que tous ces récepteurs sont partiellement responsables des diverses actions biologiques de la signalisation DAG. La famille PKD a particulièrement attiré l’attention car elle est non seulement une cible de DAG mais aussi un substrat direct de PKC3, se positionnant ainsi en aval de DAG et de PKC à une position centrale dans la voie de transduction du signal.4 − 5PKDs sont sérines / thréonine kinases qui sont maintenant classées en tant que sous-famille de la superfamille Ca2 + / kinase dépendante de la calmoduline (CaMK) 6. À ce jour, trois isoformes PKD ont été identifiées: PKD1 (anciennement PKC μ), 7,8 PKD2,9 et PKD3 (anciennement PKC ν). 10 Ils partagent une séquence hautement homologue qui comprend un domaine catalytique et un domaine régulateur. Le domaine de régulation de chaque isoforme PKD est principalement constitué d’un domaine C1, qui se lie aux esters DAG / phorbol, et d’un domaine d’homologie de la pleckstrine (PH), qui intervient dans les interactions protéiques et l’auto-inhibition du PKD.7 − La PKC est connue pour activer la PKD par interaction directe avec le domaine PH de la PKD et la transphosphorylation de sa boucle d’activation sur les sérums conservés Ser744 et Ser748.3,11. L’autophosphorylation subséquente se produit sur plusieurs sites, y compris Ser916.12 En outre, DAG régule la localisation intracellulaire de PKD en se liant à son domaine C1.4 − 5 En effet, la PKD activée semble être mobile et capable de faire la navette entre différents compartiments subcellulaires. En conséquence, la cascade de signalisation DAG-PKC-PKD représente un mécanisme clé qui contrôle la fonction PKD dans les cellules. Des preuves récentes indiquent également que la PKD peut être activée indépendamment de la PKC, ajoutant à la complexité du réseau de signalisation.40 PKD contribue à une gamme de réponses cellulaires, y compris la prolifération cellulaire, la survie cellulaire par l’activation induite par le stress oxydatif du facteur nucléaire kappaB ( NF – κ B) la signalisation, l’expression génique par la régulation des histones déacétylases de classe IIa, le trafic de protéines du Golgi à la membrane plasmique, la motilité cellulaire, et les réponses immunitaires.4 − 5,13,41 Ce rôle omniprésent de La PKD au niveau cellulaire explique son implication dans des processus pathologiques tels que l’hypertrophie cardiaque, 14,42 angiogenèse, 15,16 ainsi que la prolifération des cellules tumorales et les métastases, constituant ainsi une cible thérapeutique potentielle pour les maladies cardiovasculaires et l’oncologie. .13,41Le manque de spécificité des premiers inhibiteurs de la PKD, à savoir l’isoquinoline sulfonamide H89, les analogues de la staurosporine et le resvératrol, a considérablement entravé la poursuite de l’analyse. de la régulation et de la biologie de cette kinase, mais plus récemment, plusieurs autres inhibiteurs sélectifs ont été signalés.13,41,42,43 Une réalisation significative dans ce domaine a été récemment réalisée par l’identification et la caractérisation du CID755673, le premier puissant et sélectif. Inhibiteur de la PKD (Tableau 1) .20 CID755673 inhibe les PKD avec une IC50 in vitro de 182 nM pour PKD1, de 280 nM pour PKD2 et de 227 nM pour PKD3. En plus de sa puissance, CID755673 était unique car il n’était pas un inhibiteur compétitif de l’ATP, ce qui implique qu’il peut se lier à un autre site sur PKD et, par conséquent, offrir une plus grande sélectivité pour PKD vs autres protéines kinases. CID755673 bloquait efficacement les fonctions cellulaires médiées par PKD et révélait de nouvelles fonctions promotrices des tumeurs des isoformes PKD dans les cellules cancéreuses de la prostate. 20Herein, nous rapportons nos efforts de structure et de relation d’activité (SAR) basés sur CID755673. La recherche de plus amples informations sur l’interaction de liaison et l’identification d’analogues plus puissants a été guidée par la dissection du composé parent CID755673 dans quatre zones structurales majeures (Tableau 1): zone I (fragment aryle), zone II (furane), zone III (azépine) et zone IV (fonction amide) .21 Les composés résultant des modifications structurales de chacune de ces zones ont été évalués in vitro et dans des cellules pour leur activité inhibitrice de la PKD1. Parmi les ca. 50 analogues ont été préparés, les données les plus représentatives de chaque série sont résumées dans le tableau 1. Toutes les modifications de la zone IV, qui comprenaient des interconversions de groupes fonctionnels et le remplacement du fragment amide, n’ont pas amélioré l’activité inhibitrice (données non présentées). Dans la zone II, le remplacement de l’oxygène dans le composé parent CID755673 par un atome d’azote conduit à une puissance équivalente ou légèrement améliorée, comme illustré par le pyrrole kb-NB123-57, qui présente une CI50 de 130 nM. Fait intéressant, le remplacement de l’oxygène par un atome de soufre a significativement amélioré l’activité et conduit à la découverte de la puissante benzothiénothiazépinone kb-NB142-70, présentant une IC50 in vitro de 28,3 nM.Zone I modifications incluses fonctionnalisation à travers le fragment aryle et des substitutions sur le groupe hydroxyle phénolique.La plupart de ces dérivés de la zone I étaient moins actifs que CID755673. Plus précisément, les substituants du carbone ortho par rapport au phénol et les O-benzylations étaient nuisibles, tandis que l’orthohalogénation21 a eu un effet mineur sur l’activité in vitro (données non présentées). De plus, la O-méthylation du phénol a été bien tolérée, comme l’illustre une CI50 de 82,5 nM pour l’analogue méthoxy, kb-NB165-09. Cette puissance remarquable de l’éther méthylique par rapport au phénol kb-NB142-70 peut indiquer qu’un donneur de liaison hydrogène à cette position n’est pas crucial pour l’activité. En revanche, la perte dramatique d’activité de l’analogue benzylique suggère que la zone de la poche I dans la protéine est stériquement limitante. Notamment, l’analogue d’azide mcf292-08 a maintenu une activité inhibitrice élevée avec une CI50 de 74,9 nM. Ce résultat confirme la signification limitée d’un donneur de liaison hydrogène à cette position et suggère également qu’un groupe azoture peut s’adapter assez bien à l’intérieur de la poche de liaison stériquement restreinte.En zone III, la taille du cycle a été modifiée par addition ou élimination de groupes méthylène. à la position benzylique. Concomitant à la modification de la zone II par un thiophène, l’insertion de thioéther exo dans l’hétérocycle à cinq chaînons n’a pas nui à l’activité, comme le montrent les kb-NB142-70 et kb-NB165-09, bien qu’aucune conclusion n’ait pu être tirée à ce la contribution relative de chaque modification. De plus, l’augmentation de la taille du cycle de 7 à 8 atomes en insérant un groupe méthylène supplémentaire dans la zone III a également été bien tolérée, comme le suggèrent l’activité des benzothiénothiazocinones kb-NB184-02 (IC50 193 nM) et kb-NB165-92 ( CI50 111 nM). Il convient également de noter que dans le cas de l’anneau à 8 chaînons, la même tendance s’applique à l’activité légèrement diminuée du substituant méthoxy par rapport au phénol libre dans la zone I. Tableau 1 Structure chimique, analyse SAR et activité inhibitrice de la PKD de CID755673 et analogues synthétiques sélectionnés La synthèse d’analogues représentatifs dans chaque série a nécessité le développement de voies de synthèse flexibles. β -Carboline kb-NB123-57 a été préparée à partir de la phénylhydrazine 2 par une synthèse de l’indole de type Fischer avec le α -cétolactame à 7 membres correspondant, obtenue in situ par hydrolyse catalysée par l’acide de l’énamine 1 (Schéma 1 ) .22 Débenzylation par hydrogénation par transfert conduit au phénol kb-NB123-57.23Schéma 1Synthèse de la β -Carboline Analogues kb-NB123-57Benzothienothiazepinones kb-NB142-70 et kb-NB165-09 ont été synthétisés selon un protocole de la littérature24 25, en commençant par la protection par le benzyle de l’acide 3-hydroxycinnamique disponible dans le commerce (Schéma 2). La cyclisation Higa à médiation par le chlorure de thionyle de l’acide 4 a fourni le chlorure d’acide benzo [b] thiophène, qui a ensuite été converti en ester méthylique 5. Un traitement de 5 avec du chlorhydrate de cystéamine en présence de DBU a entraîné la formation du noyau de benzothiénothiazépinone désiré.25 Déprotection de l’arylbenzyléther avec du tribromure de bore fournit kb-NB142-70 avec un bon rendement, et O-méthylation de kb-NB142-70 avec de l’iodure de méthyle conduit à kb-NB165-09.Schéma 2Synthèse des analogues de benzothiéniazépinone kb-NB142-70 et kb-NB165-09Pour synthétiser les benzothiophènes kb-NB165-92 et kb-NB184-02 annulés par la thiazocinone, on obtient le chlorhydrate d’aminopropanethiol 8 par ouverture de thiazinanethione 7, préparée en deux étapes à partir de 3-amino-1 disponible dans le commerce. -propanol (schéma 3) .26 L’aminothiol 8 a été isolé sous la forme d’un mélange thiol / disulfure à environ 1: 1,3 et utilisé directement dans la séquence de déprotection de cyclocondensation pour donner le benzothiénothiozo souhaité. La synthèse des benzothiénothiazocinones kb-NB165-92 et kb-NB184-02 Le remplacement du groupe phénol par un azide sur l’échafaudage benzothiophène a nécessité le développement d’une voie alternative (Schéma 4). La substitution nucléophile aromatique du 2-chloro-5-nitrobenzoate de méthyle par l’anion thioglycolate de méthyle suivie de la cyclisation immédiate de Dieckman27,28 a donné le précurseur de benzothiophène 10. La cyclisation du triflate correspondant 11 avec le chlorhydrate de cystéamine a fourni le noyau tricyclique désiré 12 avec un rendement de 50% ( 67% sur la base du matériau de départ récupéré 10). Après réduction du groupe nitro, traitement de l’aniline 13 avec du nitrite de tert-butyle et du TMS-azide en utilisant Moses ’ méthode29 a donné l’aryl azide mcf292-08.Schéma 4Synthèse de l’Azidobenzothienothiazepinone Analogique mcf292-08Our SAR a établi que, en général, benzothienothiazepinones étaient supérieurs pour l’inhibition de la PKD par rapport aux benzofuroazepinones. La benzothiénothiazépinone kb-NB142-70 était l’analogue le plus puissant, avec une CI50 in vitro de 28 nM pour PKD1, ce qui a permis d’obtenir une amélioration de près de 7 fois de la puissance par rapport à la structure antérieure en plomb CID755673. Cette tendance a été encore confirmée dans les dosages cellulaires, pour lesquels la CI50 cellulaire a été abaissée de 11 fois.8 μ M pour l’inhibition de l’activation de la PKD1 endogène induite par le PMA par CID755673 à un chiffre 2.2 μ M par kb-NB142-70. Bien que ce résultat ait été bon pour la capacité de kb-NB142-70 à inhiber la PKD1 dans les cellules intactes, des études in vivo ont révélé une demi-vie plasmatique courte pour la benzothiénothiazépinone.30 En conséquence, nous avons exploré une modification de la zone I de kb-NB142- 70 pour installer un fragment de pyrimidine plus déficient en électrons à la place de l’éther de phénol, un site connu de métabolisme actif de phase I et II. La voie de synthèse pour arriver à cette nouvelle structure de thiazépinothiophénopyrimidinone est résumée dans le schéma 5. Commencer avec méthyle 3 disponible dans le commerce -aminothiophène-2-carboxylate, la formation de la fraction pyrimidine en utilisant du cyanate de potassium, suivie d’une chloration avec POCl3 donne du dichlorure 15.31 La déchloration régiosélective catalysée par le palladium de 15 en présence de Na2CO3 se produit exclusivement en position C-4, 32 et le chlorure de C-2 restant avec le méthoxyde fournit 17 à 79% de rendement sur les deux étapes. Une bromation électrophile de 17 en utilisant du brome dans AcOH33 a donné le composé bromé en C-7 désiré. La fonctionnalisation en C-6 dans les conditions de Knochel a donné le précurseur de cyclisation requis 19. La formation de la fraction thiazépinone a ensuite été réalisée par nucléophilie monocanal. déplacement de 19 avec le chlorhydrate de cystéamine, fournissant la méthoxypyrimidine désirée kmg-NB4-23 avec un bon rendement.Série 5Synthèse de la thiazépinothiophénopyrimidinone Analgique kmg-NB4-23Cratiquement, la pyrimidine kmg-NB4-23 présentait une CI50 de 124 nM, qui est seulement une légère diminution de l’activité par rapport à celle de la dérivée parentale kb-NB165-09. Ce résultat encourageant confirme donc la validité de notre conception et suggère également qu’une densité d’électrons réduite est bien tolérée dans la région aryle. Afin d’établir le profil de sélectivité de notre série d’analogues par rapport à d’autres kinases, nous avons également effectué une variété de contre-écrans utilisant AKT, CAK (CDK7), PLK1, PLK2, plusieurs PKC et CaMK &#x003b1 ;. Contrairement à l’activité nanomolaire faible de nos analogues contre la PKD, aucun de nos inhibiteurs ne s’est avéré être significativement actif à des concentrations de M dans ces criblages. De plus, nous avons testé la sélectivité de nos sondes kmg-NB4-23, mcf292-08 et kb-NB123-57 contre PKC &#x003b1 ;, PKC β I et PKC &#x003b4 ;, ​​et nous n’avons pas détecté d’activités significatives dans ces dosages. Pour CaMKII α, nous avons trouvé une inhibition faible (< 40%) à 10 μ M pour mcf292-08 et kb-NB123-57. Ces contre-écrans établissent clairement un profil de sélectivité élevé pour l'inhibition de la PKD dans nos séries analogues.35 Nous avons également commencé à sonder les effets cellulaires de kmg-NB4-23, mcf292-08 et kb-NB123-57.35 L'azidobenzothienothiazepinone mcf292-08 inhibait PMA- autophosphorylation de PKD1 S916 induite dans des cellules de cancer de la prostate LNCaP avec une CI50 de 2,2 μ M. Pour la thiazépinothiophénopyrimidinone kmg-NB4-23, une CI50 de 6,8 μ M a été trouvée dans cet essai. En revanche, kb-NB123-57 n'a pas inhibé significativement l'autophosphorylation PKD1 induite par PMA à S916 (IC50 > 50 μ M), peut-être en raison de la perméabilité membranaire limitée, liaison protéique indésirable, dégradation métabolique ou autre voies de compensation dans les cellules.En résumé, nous avons identifié une série de nouvelles benzothiénothiazépinones comme inhibiteurs de la PKD. Un premier cycle d’optimisation à partir du lead initial CID755673 a conduit à la découverte de kb-NB142-70 et de son analogue méthoxy kb-NB165-09. Ces nouveaux composés principaux ont inhibé la PKD1 in vitro dans la plage nanomolaire inférieure, atteignant une amélioration de près de un log-IC50 par rapport au hit HID CID755673 cancer du rein. En outre, ils ont inhibé l’autophosphorylation de PKD1 à Ser916 dans les cellules cancéreuses de la prostate LNCaP dans la gamme micromolaire faible, une amélioration de 10 fois par rapport au cas de CID755673. Afin de contourner les problèmes de métabolisme, une autre modification du noyau avec une fraction de pyrimidine a conduit à la nouvelle structure de plomb prometteuse kmg-NB4-23. Des études SAR sont actuellement en cours pour améliorer l’activité de kmg-NB4-23 ainsi que sa sélectivité envers PKD1 vs PKD2 ou PKD3, pour lesquelles les valeurs IC50 ont été trouvées dans la gamme 50 nM pour tous les dérivés testés (données pas montré). En conclusion, nos résultats à ce jour démontrent que les modifications de CID755673 modulent significativement sa puissance mais n’ont qu’un effet limité sur la sélectivité isoforme.21 Cela suggère que le domaine de liaison peut être hautement conservé parmi les trois isoformes. Enfin, l’analogue azoté mcf292-08, également actif à des concentrations nanomolaires (in vitro) ou micromolaires (dans les cellules), représente un outil précieux pour les futures études de marquage de photoaffinité pouvant fournir des informations structurales clés pour l’identification du site de liaison.